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Jul 26, 2023

Base estructural para la formación de poros GSDMB y su orientación por IpaH7.8

Naturaleza volumen 616, páginas

Nature, volumen 616, páginas 590–597 (2023)Citar este artículo

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Las gasderminas (GSDM) son proteínas formadoras de poros que desempeñan un papel fundamental en la defensa del huésped a través de la piroptosis1,2. Entre los GSDM, GSDMB es único debido a su perfil distintivo de unión a lípidos y la falta de consenso sobre su potencial piroptótico3,4,5,6,7. Recientemente, se demostró que GSDMB exhibe actividad bactericida directa a través de su actividad formadora de poros4. Shigella, un enteropatógeno intracelular adaptado a humanos, evade esta defensa del huésped mediada por GSDMB al secretar IpaH7.8, un efector de virulencia que desencadena la degradación proteasomal dependiente de ubiquitinación de GSDMB4. Aquí, informamos las estructuras de microscopía electrónica criogénica de GSDMB humano en complejo con Shigella IpaH7.8 y el poro GSDMB. La estructura del complejo GSDMB-IpaH7.8 identifica un motivo de tres residuos cargados negativamente en GSDMB como el determinante estructural reconocido por IpaH7.8. El GSDMD humano, pero no el de ratón, contiene este motivo conservado, lo que explica la especificidad de especie de IpaH7.8. La estructura de poros de GSDMB muestra el enlazador interdominio regulado por empalme alternativo en GSDMB como regulador de la formación de poros de GSDMB. Las isoformas de GSDMB con un enlazador de interdominio canónico exhiben actividad piroptótica normal mientras que otras isoformas exhiben actividad piroptótica atenuada o nula. En general, este trabajo arroja luz sobre los mecanismos moleculares del reconocimiento de Shigella IpaH7.8 y la orientación de GSDM y muestra un determinante estructural en GSDMB crítico para su actividad piroptótica.

Las proteínas de gasdermina (GSDM) constan de un dominio formador de poros N-terminal (GSDM-N), un dominio autoinhibidor C-terminal (GSDM-C) y un enlazador entre dominios7,8,9,10,11,12,13,14 ,15. El GSDMB humano tiene múltiples isoformas de empalme (isoformas 1–6, Q8TAX9; UniProt) que varían en sus enlazadores entre dominios. Las isoformas 1, 4 y 6 contienen enlazadores entre dominios "canónicos", mientras que las isoformas 2 y 3 contienen enlazadores truncados y la isoforma 5 comprende solo el dominio C-terminal16. Si bien la GSDMB induce piroptosis sigue siendo controvertida, un estudio reciente mostró que la GSDMB se dirige preferentemente a la membrana bacteriana y restringe el crecimiento microbiano y se propaga directamente durante la infección4,13. Este proceso, sin embargo, es subvertido por Shigella, una bacteria Gram-negativa altamente infecciosa que causa gastroenteritis aguda17, a través de su proteína efectora secretada, IpaH7.8 (ref. 4). Sorprendentemente, IpaH7.8 también se une a GSDMD además de GSDMB. Sin embargo, IpaH7.8 ubiquitina solo GSDMD18 humano, pero no de ratón, lo que puede estar relacionado con el hecho de que los humanos y los primates no humanos son los reservorios naturales de Shigella, mientras que los ratones no lo son19. Se desconocen los mecanismos moleculares de por qué GSDMB funciona de manera distinta de otros GSDM en la inducción de piroptosis, y cómo Shigella IpaH7.8 reconoce específicamente GSDMB y GSDMD humana.

Para comprender cómo Shigella IpaH7.8 reconoce GSDMB, determinamos la estructura de microscopía electrónica criogénica (crio-EM) de GSDMB humana (isoforma 1, Q8TAX9-1) en complejo con Shigella flexneri IpaH7.8 a una resolución general de 3,8 Å (Datos extendidos Fig. 1 y Tabla de datos extendidos 1). La estructura muestra un complejo 1: 1 con el dominio IpaH7.8-LRR que se une a GSDMB-N (Fig. 1a, b). IpaH7.8-LRR se organiza en una estructura de solenoide ligeramente curvada que contiene nueve motivos LRR cubiertos por dos hélices α N-terminal (α1 y α2) y una hélice α4 C-terminal, junto con una hebra β10 paralela que aumenta directamente la β -hoja de LRR (Fig. 1c). La arquitectura general de IpaH7.8-LRR es muy similar a las estructuras informadas anteriormente de los dominios LRR en IpaH1.4 e IpaH3 (refs. 20, 21) (Fig. 1d). La densidad del dominio NEL C-terminal IpaH7.8 no es visible en el mapa, probablemente debido a su flexibilidad en el complejo, lo que permite la ubiquitinación de múltiples lisinas en GSDMB4 (Datos extendidos Fig. 1c).

a, esquemas de dominio de IpaH7.8 y GSDMB. Los límites del dominio están etiquetados. b, Estructura general del complejo GSDMB–IpaH7.8 en dos vistas. El dominio LRR en IpaH7.8 y los dominios GSDMB-N- y -C-terminal están coloreados como en a. c, Diagrama de cinta que muestra la estructura del dominio IpaH7.8-LRR. d, Superposición de IpaH7.8-LRR (salmón) en dominios LRR IpaH1.4 (amarillo; PDB: 7V8H) e IpaH3 (cian; PDB: 3CVR). e, Estructura general de GSDMB (izquierda) y superposición de las estructuras de GSDMB y GSDMA3 de ratón (PDB: 5B5R) (derecha). La hebra β4 en GSDMA3 de ratón no se observa en la estructura GSDMB. Dominios N- y C-terminales de GSDMA3 de color marrón y gris, respectivamente. f, Vista de primer plano de la interfaz entre la hélice α4 del terminal GSDMB-N y el GSDMB-C. GSDMB-C se muestra como potenciales electrostáticos y la hélice α4 de GSDMB-N-terminal como una caricatura, con residuos hidrofóbicos involucrados en la interacción que se muestran como palos. NT, dominio N-terminal; CT, dominio C-terminal.

GSDMB adopta una conformación autoinhibida muy similar a la de GSDMA3 y GSDMD7,8 (Fig. 1e). La hebra β4 pronosticada (en referencia a la estructura GSDMA3) no se observó en la densidad, mientras que la hélice α4 sobresale del GSDMB-N para ponerse en contacto con GSDMB-C (Fig. 1e). La resolución local de GSDMB-C es relativamente más baja que la del núcleo GSDMB-N/IpaH7.8-LRR, lo que indica una dinámica entre los dominios N- y C-terminal de GSDMB (Datos extendidos Fig. 1c). A pesar de su baja resolución, pudimos rastrear la cadena principal de GSDMB-C, que adopta un paquete que consta de ocho hélices similares a las estructuras cristalinas previamente determinadas6 (Fig. 1e y Extended Data Fig. 2a). Se pensó que GSDMB tenía una autoinhibición reducida en su estructura de longitud completa debido a (1) su capacidad para unir fosfatos y sulfátidos de fosfatidilinositol sin escisión y (2) su falta de un subdominio en GSDMB-C que es esencial para las interacciones entre dominios6, 22 (Datos ampliados Fig. 2b). En nuestra estructura, GSDMB-C atrapa la hélice GSDMB-N α4 que sobresale a través de un surco hidrofóbico gigantesco formado por las hélices α9, α10 y α12 en lugar de las hélices α9 y α11 aportadas por el subdominio en GSDMA3, lo que da como resultado una interfaz entre dominios aún más grande en GSDMB (área de interfaz total de 3020 Å2 en GSDMB frente a 2745 Å2 en GSDMA3) (Fig. 1e,f). Especulamos que GSDMB de longitud completa podría usar un mecanismo diferente para la unión de fosfolípidos que no sea la escisión.

En el complejo GSDMB-IpaH7.8, seis de los nueve motivos LRR en IpaH7.8-LRR interactúan con GSDMB-N, lo que da como resultado un área de superficie enterrada total de aproximadamente 1826 Å2 entre las dos proteínas, con áreas de interacción clave divisibles en dos parches, I y II. LRR7–LRR9 de IpaH7.8 entran en contacto con un bucle corto (bucle α1–β1', residuos 15–21) que contiene varios residuos cargados negativamente en GSDMB-N para formar el primer parche (I), mientras que IpaH7.8-LRR4–6 interactúan con la hebra β3 en el primer dominio de extensión (ED1)9,23 en GSDMB formando el segundo parche (II) (Fig. 2a).

a, Las dos interfaces entre GSDMB e IpaH7.8 están resaltadas por cuadros discontinuos. b, interacciones detalladas en el parche de interfaz I. Los residuos que participan en esta interfaz se muestran como bolas y palos; los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas de puntos grises. c, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS teñida con azul de Coomassie (SDS-PAGE) de reacciones de ubiquitinación in vitro usando GSDMB (WT y mutantes) e IpaH7.8. Resultados representativos de tres experimentos independientes. d, Interacciones detalladas en el parche de interfaz II. Los residuos que participan en esta interfaz se muestran como bolas y palos; los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas de puntos grises. e, SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie de la ubiquitinación in vitro de GSDMB por IpaH7.8 (WT o mutantes). Resultados representativos de tres experimentos independientes. f, inmunotransferencias de ubiquitinación de GSDMB en células HEK293T cotransfectadas con GSDMB marcado con FLAG y HA-IpaH7.8 (WT o mutantes). WCL, lisados ​​de células completas. Resultados representativos de tres experimentos independientes. g, SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie de la ubiquitinación in vitro de GSDMB o GSDMD humana (WT y mutantes) por IpaH7.8. Resultados representativos de tres experimentos independientes. h, SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie de ubiquitinación in vitro de GSDMD de ratón (WT y mutantes) por IpaH7.8. D17HG y D17AG reemplazan la secuencia no conservada (S17GSR20) en GSDMD de ratón por las secuencias GSDMD y GSDMB humanas correspondientes, respectivamente. La alineación de la secuencia de aminoácidos del motivo α1–β1' (subrayado) entre GSDMB y GSDMD humano y de ratón se muestra arriba de SDS-PAGE. Las secuencias intercambiadas entre tres GSDM están resaltadas por el cuadro rojo. Resultados representativos de tres experimentos independientes. i, j, SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie de reacciones de ubiquitinación in vitro usando IpaH7.8 y GSDMB (WT y mutantes). La hebra β3 en GSDMB se mutó como se indica en i o se intercambió por las correspondientes secuencias de GSDMD humana (hβ3) y de ratón (mβ3) en j. El control en j indicó la ubiquitinación de WT GSDMB con el mutante IpaH7.8C357. Resultados representativos de tres experimentos independientes.

El parche de interfaz I está mediado principalmente por interacciones polares. En particular, las cadenas laterales de Q185 y R186 de LRR7, Y207 y H209 de LRR8 y R228, N230 y S232 de LRR9 en IpaH7.8 forman diez enlaces de hidrógeno con E15, D17, A18 y D21 en GSDMB. Mientras tanto, las cadenas laterales cargadas positivamente de R186 y R228 en IpaH7.8 forman puentes extrasalinos con las cadenas laterales cargadas negativamente de E15 y D21, respectivamente, en GSDMB (Fig. 2b). Curiosamente, las cadenas laterales de E15 y D17 en GSDMB se insertan en dos pequeños bolsillos básicos formados por R186 y H209 junto con los residuos circundantes en IpaH7.8 (Datos extendidos Fig. 3a). Los dos bolsillos están separados por aproximadamente 10 Å, lo que sugiere un mecanismo potencial en el que IpaH7.8 reconoce un motivo específico que contiene dos residuos ácidos a esta distancia precisa. De hecho, las mutaciones individuales de E15 o D17 en GSDMB en un residuo con carga inversa o sin carga redujeron significativa o parcialmente la ubiquitinación de GSDMB por IpaH7.8 in vitro (Fig. 2c).

El parche de interacción II está mediado por enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas y de Van der Waals. La cadena lateral de R125 de IpaH7.8-LRR4 forma dos enlaces de hidrógeno con el grupo carbonilo principal de E83 y el carboxilato de oxígeno OE1 de Q85 en GSDMB. Paralelamente, la cadena lateral de Y165 de LRR6 forma dos enlaces de hidrógeno con el grupo amino principal de L87 y el grupo carbonilo principal de Q85 en GSDMB, y Y166 de LRR6 forma un enlace de hidrógeno con el grupo carbonilo principal de L87 en GSDMB. Además, los residuos F143, E145 y N146 en LRR5, y F161 y H163 en LRR6 de IpaH7.8, entran en contacto con la hebra GSDMB β3 a través de extensas interacciones hidrofóbicas y de Van der Waals (Fig. 2d).

La alineación de secuencias basada en la estructura muestra que los residuos clave en ambos parches en IpaH7.8 son divergentes en las posiciones equivalentes en otras proteínas de la familia IpaH (datos extendidos, figura 3b), lo que convierte a IpaH7.8 en el único miembro de la familia IpaH que se dirige específicamente a GSDMB4 ,18. Las mutaciones de residuos clave en IpaH7.8, como R186E, H209G, R228D y R186E/R228D en el parche de interfaz I, y F143S, F161G/I181G, Y165A/Y166A y Y165E/Y166E en el parche de interfaz II, eliminan en gran parte o por completo el capacidad de IpaH7.8 para ubiquitinar GSDMB (Fig. 2e). Las mutaciones de R186E/R228D y Y165E/Y166E también atenúan significativamente la ubiquitinación y la degradación de GSDMB mediada por IpaH7.8 en las células (Fig. 2f, Datos extendidos Fig. 3c y Figs. 1 y 2 complementarias).

Se demostró previamente que Shigella IpaH7.8 se une a GSDMD humana y de ratón; sin embargo, ubiquitina solo GSDMD18 humano. Usando calorimetría de titulación isotérmica (ITC), caracterizamos las interacciones entre IpaH7.8 y GSDMB/D. IpaH7.8 mostró una afinidad 46 veces menor por GSDMD humano (con una constante de disociación (Kd) de 20,4 ± 1,8 μM) que por GSDMB (Kd = 0,44 ± 0,03 μM) (Datos extendidos Fig. 4a,b). Sorprendentemente, no se detectó interacción entre IpaH7.8 y GSDMD de ratón (datos extendidos, figura 4c). De acuerdo con sus afinidades, la cromatografía de filtración en gel analítica mostró que IpaH7.8 comigraba eficientemente con GSDMB y parcialmente con GSDMD humana, mientras que apenas comigraba con GSDMD de ratón (Datos extendidos Fig. 4d-f). Por lo tanto, concluimos que Shigella IpaH7.8 se une a GSDMD humana pero no de ratón.

La sustitución de un fragmento cerca del extremo N (residuos 16–21) por la secuencia humana rescató con éxito la degradación mediada por IpaH7.8 de GSDMD de ratón en células18. En nuestra estructura compleja, este fragmento corresponde al bucle α1–β1 'en GSDMB en el que un motivo de tres residuos cargados negativamente (motivo α1–β1') interactúa ampliamente con IpaH7.8 (Fig. 2b). La alineación de secuencias basada en la estructura mostró que este motivo se conserva en GSDMD humano pero no en ratón (E15MD17AGGD21 en GSDMB, E15LD17HGGD21 en GSDMD humano y E15VS17GSR20GD22 en GSDMD de ratón) (Datos extendidos Fig. 2b). Mouse GSDMD contiene el E15 conservado, pero el segundo residuo ácido se sustituye por una serina (mS17). Mouse GSDMD también contiene el tercer residuo ácido conservado (mD22) pero tiene una inserción de arginina única en la posición 20 (mR20) (Datos extendidos Fig. 2b). La sustitución de D17 con una serina puede interrumpir su interacción con Y207 y N230 en IpaH7.8, mientras que la inserción de mR20 probablemente aleja al siguiente ácido aspártico (mD22) de la interacción con R228 en IpaH7.8 (Fig. 2b), bloqueando así las interacciones entre ratón GSDMD e IpaH7.8. En consecuencia, una sola mutación con una inserción de arginina en la posición 20 (R20Ins) y una doble mutación de D17S/R20Ins en GSDMB y GSDMD humana bloquearon su interacción con IpaH7.8 y posteriormente comprometieron la ubiquitinación mediada por IpaH7.8 (Fig. 2g y Extended Figura de datos 4g, h). Por otro lado, el reemplazo del motivo α1-β1 'no conservado en GSDMD de ratón con los residuos GSDMB o GSDMD humanos correspondientes rescató la ubiquitinación de GSDMD de ratón por IpaH7.8 (Fig. 2h).

A pesar de la característica estructural similar, la secuencia de aminoácidos de las cadenas β3 en los GSDM es muy divergente (Datos ampliados, Fig. 4i). Nos preguntamos si la hebra β3 en los GSDM funciona como otro determinante estructural para el reconocimiento por parte de IpaH7.8. Sin embargo, la hebra β3 en GSDMB interactúa con IpaH7.8 principalmente a través de su columna vertebral, lo que indica un modo de interacción independiente de la secuencia. De acuerdo con nuestra hipótesis, las mutaciones en la cadena β3 de GSMDB no afectaron la ubiquitinación (Fig. 2i). Además, el intercambio de cadenas β3 entre GSDMB, GSDMD humano y un mutante de GSDMD de ratón que alberga una mutación de rescate (D17HG) no afectó su ubiquitinación (Fig. 2j y Datos extendidos Fig. 4j). Por lo tanto, concluimos que el motivo de tres residuos cargados negativamente en el bucle α1–β1 'es el determinante estructural en los GSDM.

Debido a que la cadena β3 es un elemento esencial de la formación de poros de GSDM8,9,23, luego probamos si la unión de IpaH7.8 a esta cadena inhibe directamente la formación de poros de GSDMB. Como se esperaba, el GSDMB escindido con granzima A (GZMA) provocó una fuga rápida del colorante 6-carboxifluoresceína (6-FAM) de los liposomas que contenían cardiolipina (CL) 4 (Fig. 3a), lo que indica la formación de poro GSDMB. Esta pérdida de liposomas inducida por GSDMB se inhibió en gran medida en presencia de IpaH7.8, mientras que no se observó una inhibición significativa cuando se incubó GSDMB con IpaH7.8Y165E/Y166E o IpaH7.8R228D/R186E, dos mutantes de IpaH7.8 que ya no interactúan con GSDMB (Fig. 3a y datos extendidos Fig. 5a). IpaH7.8C357A, un mutante catalíticamente inactivo que todavía se une a GSDMB4,18, también atenuó la pérdida de liposomas inducida por GSDMB (Fig. 3a). La titulación de la concentración demostró además que IpaH7.8 inhibía la actividad de GSDMB de forma dependiente de la dosis, con una concentración inhibitoria media máxima (IC50) de 1,46 ± 0,11 μM (Fig. 3b y Datos ampliados, Fig. 5b). IpaH7.8 no afectó la escisión de GSDMB, pero inhibió directamente la unión de GSDMB-N a los liposomas (Datos extendidos, Fig. 5c). Curiosamente, IpaH7.8 no inhibió la fuga de liposomas causada por GSDMD humana escindida con caspasa-11 (Datos extendidos Fig. 5d). La asociación de GSDMD-N humano con liposomas fue inhibida solo por concentraciones muy altas de IpaH7.8 (Datos extendidos Fig. 5e).

a, La capacidad de GSDMB para inducir la fuga de liposomas que contienen CL (liposomas CL) cuando se incuba con IpaH7.8 (WT o mutantes indicados). b, Curva dosis-respuesta de IpaH7.8 en la inhibición de la actividad formadora de poros de GSDMB en un ensayo de pérdida de liposomas. La pendiente inicial del aumento de la fluorescencia (RU min–1) se representó frente al logaritmo de la concentración de IpaH7.8 para determinar la IC50 de IpaH7.8. RU, unidad relativa de fluorescencia. a,b, Cada punto representa la media ± sd de tres repeticiones técnicas. c, Inhibición de la muerte bacteriana mediada por GSDMB por IpaH7.8. WT: tipo salvaje; AA: Y165E/Y166R; TR: R186E/R228D. Barras de error, media ± sd de tres experimentos independientes. *P < 0,05, **P < 0,005, ***P < 0,0005. Análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey en comparación con el control de tampón. d, ensayo de sedimentación de liposomas que muestra la asociación de GSDMB ubiquitinado y no ubiquitinado con liposomas CL. Los sobrenadantes y los sedimentos (liposomas) se analizaron mediante SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie. FL, longitud completa. e, Efecto de la ubiquitinación sobre la inhibición de las actividades de formación de poros de GSDMB en la inducción de la liberación de fluorescencia de los liposomas CL. Cada punto representa la media ± sd de tres repeticiones técnicas. f, se muestran las lisinas en la región transmembrana, las interfaces de unión a lípidos y de oligomerización tanto en GSDMB como en GSDMD humana. g, SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie de ubiquitinación in vitro de mutantes de GSDMB que no albergan lisina (allKR) o lisina única (como se indica). Resultados representativos de tres experimentos independientes. h, Supervisión de las actividades de formación de poros de mutantes de GSDMB ubiquitinados de g utilizando con liposomas CL. Las mediciones de fluorescencia se tomaron en el punto de tiempo de 30 min. Los resultados representan la media ± sd de tres repeticiones técnicas. i, Supervisión de la actividad de formación de poros del mutante GSDMB3R ubiquitinado. GSDMB3R: K177/K190/K192 se mutan en argininas en GSDMB. Cada punto representa la media ± sd de tres repeticiones técnicas.

Debido a que GSDMB posee actividad microbicida directa mediante el reconocimiento de fosfolípidos específicos en la membrana bacteriana4, luego examinamos si IpaH7.8 inhibe directamente la actividad antibacteriana de GSDMB. Descubrimos que aproximadamente el 50 % de Escherichia coli DH5α se eliminó cuando se expuso a GSDMB escindido con GZMA, mientras que la viabilidad bacteriana se rescató significativamente mediante la adición de IpaH7.8 de tipo salvaje (WT), pero no con los mutantes IpaH7.8Y165E/Y166E e IpaH7. .8R186E/R228D. GSDMB de longitud completa o IpaH7.8 solos no mostraron ningún efecto sobre el crecimiento bacteriano (Fig. 3c). Estas observaciones sugieren que IpaH7.8 es un inhibidor directo de GSDMB.

La ubiquitinación mediada por IpaH7.8 en sí misma fue insuficiente para evitar que GSDMD se asociara con las membranas 18 (Datos extendidos, Fig. 5f). La inhibición de la piroptosis mediada por GSDMD por IpaH7.8 se basa en la degradación proteasómica posterior18. De acuerdo con este informe, nuestro ensayo de fuga de liposomas mostró una actividad de GSDMD humana ubiquitinada comparable a la no ubiquitinada (Datos extendidos Fig. 5g). Sin embargo, inesperadamente, la GSDMB ubiquitinada perdió casi por completo su capacidad para asociarse con los liposomas y su actividad de formación de poros para inducir la fuga de liposomas (Fig. 3d, e).

Luego nos preguntamos qué lisinas en GSDMB-N son responsables de la inhibición mediada por ubiquitinación de la actividad de formación de poros. GSDMB contiene 31 lisinas con 16 en el dominio de formación de poros, mientras que solo hay 15 lisinas en GSDMD humana, entre las cuales 12 están en el dominio de formación de poros. Entre estas lisinas, K14 es única en GSDMB y se ubica en el extremo C de la hélice α1, una región involucrada en el ensamblaje de poros de GSDM9,23, y K43 se ubica cerca de la interfaz de unión a lípidos. La ubiquitinación de K14 y K43 puede afectar la oligomerización de GSDMB-N y la unión a lípidos. K102, K177, K190 y K192 se ubican en la región transmembrana y se conservan tanto en GSDMB como en GSDMD; sin embargo, están más enterrados en la membrana en GSDMB que en GSDMD (Fig. 3f y Datos extendidos Fig. 6). La ubiquitinación de estos residuos puede afectar la inserción de GSDMB en la membrana. Para examinar estas posibilidades experimentalmente, generamos una construcción GSDMB con todas las lisinas mutadas en argininas (mutante allR) y construcciones que poseen una sola lisina (K14, K102 o K177) o dos lisinas (K190/K192). El ensayo de ubiquitinación in vitro mostró que todas estas construcciones de GSDMB desencadenaron la activación de la actividad de ligasa E3 de IpaH7.8, lo que indica el plegamiento correcto de estos mutantes y su capacidad para unirse a IpaH7.8 (ref. 24) (Fig. 3g, poli-Ub ). Sin embargo, solo GSDMBK177 y GSDMBK190/K192 fueron ubiquitinados por IpaH7.8 (Fig. 3g, desaparición de GSDMB-FL en comparación con las entradas). En consecuencia, los mutantes GSDMBK177 y GSDMBK190/K192 ubiquitinados mostraron actividades significativamente atenuadas en la inducción de la fuga de liposomas (Fig. 3h). A continuación, mutamos las tres lisinas (K177, K190 y K192) en WT GSDMB (mutante 3R) y probamos el efecto sobre la ubiquitinación y la actividad de formación de poros. El mutante GSDMB3R todavía se sometió a ubiquitinación por IpaH7.8, lo que indica la existencia de otros sitios de ubiquitinación en GSDMB4, 18 (Datos extendidos Fig. 5h). Sin embargo, el GSDMB3R ubiquitinado poseía una actividad de formación de poros comparable a la no ubiquitinada (Fig. 3i). Colectivamente, concluimos que la ubiquitinación de GSMDB por IpaH7.8 en K177, K190 y K192 es suficiente para inhibir su actividad de formación de poros sin el requisito de degradación proteasomal.

A pesar de su actividad bactericida directa4, aún no es concluyente si GSDMB induce piroptosis. Notamos que los enlazadores entre dominios en cinco isoformas de GSDMB humana (isoformas 1–4 y 6) varían tanto en longitud como en secuencia25 (Fig. 4a y Datos extendidos Fig. 6). El enlazador no participa en la interacción GSDMB-IpaH7.8 (Fig. 1e), y las cinco isoformas de GSDMB fueron igualmente objetivo de IpaH7.8 para la ubiquitinación e inhibición (Datos extendidos Fig. 7a, b); el enlazador tampoco afecta la escisión de GZMA (Datos extendidos Fig. 7c). Más bien, el enlazador puede desempeñar funciones en la regulación de la actividad de formación de poros de GSDMB3. Estudios previos han demostrado que las isoformas 4 y 6 de GSDMB que contienen la secuencia canónica en el enlazador interdominio mostraron fuertes actividades de permeabilización de membrana tanto in vitro como en células5,7, mientras que la isoforma 2, que carece de la secuencia canónica, no tiene actividad piroptótica3. Sorprendentemente, la isoforma 1, que también contiene la secuencia canónica en su enlazador entre dominios, no induce la muerte celular piroptótica; más bien, se dirige a las membranas bacterianas para matar bacterias4. De manera consistente, encontramos que las células transfectadas con el dominio N-terminal de las isoformas 4 o 6, pero no con las isoformas 1, 2 o 3, exhibieron una marcada muerte celular piroptótica en comparación con las células transfectadas con GSDMB de longitud completa (Fig. 4b y Datos extendidos Fig. 7d). Curiosamente, la muerte celular piroptótica mediada por la isoforma 4 se inhibió significativamente cuando se coexpresó con Shigella IpaH7.8. Esta inhibición fue independiente de la actividad de ligasa E3 de IpaH7.8 (datos extendidos Fig. 7e,f), lo que confirma aún más que la unión de IpaH7.8 había inhibido directamente la actividad de formación de poros de GSDMB. Para examinar más a fondo las actividades de formación de poros de las isoformas de GSDMB contra las membranas plasmáticas de mamíferos in vitro, realizamos un ensayo de fuga de liposomas utilizando liposomas que contenían 10 % de fosfatidilserina (PS). Nuestros resultados mostraron que las isoformas 4 y 6 exhibieron fuertes actividades de permeabilización hacia los liposomas PS, mientras que las isoformas 2 y 3 no mostraron actividad de permeabilización de la membrana (Fig. 4c). También se observaron resultados similares para los liposomas que comprenden extractos de lípidos polares de hígado (Fig. 4d). Curiosamente, la isoforma 1 exhibió solo del 20 al 40% de la actividad de formación de poros en comparación con las isoformas 4 y 6 (Fig. 4c, d). La débil actividad permeabilizante de la isoforma 1 de GSDMB probablemente no sea lo suficientemente fuerte para superar los esfuerzos de reparación de la membrana por parte de la maquinaria celular, incluida la ESCRT-III26, para inducir la piroptosis, mientras que es suficiente para matar las bacterias que carecen de mecanismos de reparación de la membrana, aunque la toxicidad de la isoforma 1 para las bacterias fue ligeramente más débil que el de las isoformas 4 y 6 (Datos extendidos Fig. 7g). Estos datos indican que las isoformas de GSDMB que varían en sus enlazadores entre dominios exhiben distintas actividades de formación de poros.

a, Esquema de las isoformas 1–4 y 6 de GSDMB. Se muestran las secuencias de aminoácidos (aa) de los enlazadores entre dominios. Las secuencias canónicas están coloreadas en naranja y subrayadas, los tres residuos cargados positivamente que median la unión de lípidos están resaltados en azul y el sitio de escisión de GZMA está marcado. La isoforma 5 no se muestra porque no contiene el dominio formador de poros N-terminal. b, Citotoxicidad de las isoformas de GSDMB según lo medido por el ensayo de doble tinción de Hoechst/yoduro de propidio (PI) en células HEK293T transfectadas transitoriamente. Barras de error, media ± sd de tres experimentos independientes. ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey. ****P < 0,00001. c, d, Supervisión de las actividades de formación de poros de las isoformas de GSDMB purificadas utilizando liposomas que contienen 10 % de PS (c) y liposomas que comprenden extractos de lípidos polares vivos (d). Cada punto representa la media ± sd de tres repeticiones técnicas.

Para abordar la cuestión de por qué las isoformas de GSDMB exhiben distintas actividades de formación de poros, buscamos determinar la estructura crio-EM del poro de GSDMB. Aunque las isoformas 1, 4 y 6 de GSDMB formaron poros similares en tamaño y forma, los de la isoforma 1 mostraron menos agregación que los de las isoformas 4 y 6, y se observó que los poros de la isoforma 1 estaban distribuidos uniformemente en rejillas crio-EM (figura de datos ampliada). 8a,b). Por lo tanto, sometimos la isoforma 1 de GSDMB a un análisis crio-EM. La clasificación tridimensional (3D) del conjunto de datos crio-EM recopilados produjo una clase principal de poros de barril β de GSDMB, una clase de anillos sin un barril β que representa los preporos y otras clases que representan los estados intermedios de transición preporo-poro de GSDMB9,23 ( Datos extendidos Figs. 8c y 9a,b). Se encontró que el poro GSDMB tenía una simetría de 24 a 26 veces (Fig. 5a). El refinamiento 3D del poro simétrico de 24 veces condujo a un mapa final con una resolución general de 4,96 Å, mientras que el refinamiento de enfoque mejoró la resolución local del dominio globular a 4,48 Å (Datos extendidos Fig. 8c, d y Tabla de datos extendidos 1), lo que nos permite construya un modelo atómico del poro GSDMB utilizando la estructura de GSDMB en el complejo de GSDMB/IpaH7.8 como modelo inicial.

a, Diagrama de cinta de la estructura de poro de la isoforma 1 de GSDMB de 24 subunidades ajustada a su mapa de densidad crio-EM. TM, transmembrana. b, Estructura de una subunidad GSDMB en su conformación de poro ajustada al mapa crio-EM. c, Se muestran tres sitios de unión a lípidos (BS1–3) en GSDMB, ubicados, respectivamente, en α1 y bucles β1–β2 y β7–β8. Los residuos implicados en la unión de lípidos están etiquetados. d–f, Diagrama que muestra cómo el GSDMD humano (d), la isoforma 1 (e) de GSDMB y las isoformas 4 y 6 (f) de GSDMB se anclan en las membranas. Los enlazadores entre dominios en GSDM se resaltan con los colores que se muestran. Los residuos cargados positivamente marcados en el enlazador entre dominios forman un sitio de unión a lípidos adicional (BS4). La isoforma 1 de GSDMB conserva solo un residuo cargado positivamente en el enlazador entre dominios debido a una inserción de cuatro aminoácidos. g, Supervisión de las actividades de formación de poros de la isoforma 4 de GSDMB (izquierda) y GSDMD humana (hGSDMD, derecha) mediante un ensayo de fuga de liposomas. BS4: mutaciones triples de los tres residuos básicos (R225/K227/K229 en la isoforma 4 de GSDMB y K235/K236/R238 en hGSDMD) a ácidos glutámicos. La isoforma 4 de GSDMB y hGSDMD fueron escindidas por GZMA y caspasa-11 activa, respectivamente. Cada punto representa la media ± sd de tres repeticiones técnicas. h, efecto de BS4 de la isoforma 4 de GSDMB y hGSDMD en la inducción de la muerte celular piroptótica en células HEK293T según lo monitorizado mediante el ensayo de doble tinción Hoechst/PI. NT, dominio N-terminal; NTBS4, dominio N-terminal que alberga la mutación BS4. Barras de error, media ± sd de tres experimentos independientes. ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey, **P < 0,005, ****P < 0,00005.

El poro GSDMB de 24 veces tiene un diámetro interior estimado de 150 Å, un diámetro exterior de 250 Å y una altura de 60 Å (Fig. 5a), muy similar al poro GSDMA3 de 27 veces pero mucho más pequeño que el poro GSDMD de 31 veces9 ,23. Similar a GSDMA3 y GSDMD, cada subunidad de poro GSDMB comprende un dominio globular ("palma") y dos horquillas β insertadas ("dedos") generadas a partir de residuos en los dominios de extensión 1 y 2 (ED1 y ED2, respectivamente) en el GSDMB autoinhibido de longitud completa (Fig. 5b y Datos extendidos Fig. 9c). El análisis del poro de GSDMB mostró interfaces de oligomerización conservadas observadas previamente tanto en GSDMA3 como en GSDMD9,23. La oligomerización de poros de GSDMB está mediada tanto por las hebras β insertadas en la región transmembrana como por los dominios globulares citosólicos (Datos extendidos Fig. 9d). La interacción en la región transmembrana la contribuyen los residuos que se encuentran a lo largo de las cadenas β3 y β8 vecinas entre las subunidades (Datos extendidos, Fig. 9d). La interacción en los dominios globulares adyacentes contiene principalmente residuos de la hélice α3 de una subunidad que interactúa con la región alrededor de α2 y β11 de su subunidad vecina (Datos extendidos Fig. 9d); y la hélice α1 de una subunidad yuxtapuesta de extremo con la hélice α1 de la siguiente subunidad a través de interacciones hidrofóbicas y de enlaces de hidrógeno (Datos extendidos Fig. 9d). Estas interacciones conservadas sugieren un mecanismo de oligomerización unificado en la familia GSDM, a pesar de su variabilidad en la estequiometría de ensamblaje.

Estudios previos han identificado la hélice α1 N-terminal ("pulgar", sitio de unión 1 (BS1)), el bucle β1-β2 con una punta hidrofóbica flanqueada por residuos cargados positivamente ("muñeca", sitio de unión 2 (BS2)) en el dominio globular GSDM y un sitio de unión a lípidos con carga positiva (sitio de unión 3 (BS3)) presentes en la horquilla β7–β8 insertada en la membrana como elementos estructurales para la unión a lípidos8,9,23. Como era de esperar, los tres sitios de unión se conservan en GSDMB (Fig. 5c). BS1 y BS2 contienen residuos básicos de R10 y K14 en la hélice α1 y K43, R44 y R50 en el bucle β1–β2 que interactúan con los grupos de cabeza de lípidos ácidos, y residuos hidrófobos de F46 y F47 en el bucle β1–β2 inserción de punta hidrofóbica en la bicapa lipídica como un ancla de membrana, mientras que BS3 está mediado por residuos básicos de R174 y R195 en β7 y β8 (Fig. 5c).

Luego examinamos el enlazador entre dominios. En el poro GSDMD humano, la densidad de todo el enlazador entre dominios (V229–Q241) es visible (Datos extendidos Fig. 9e). Los primeros residuos del enlazador entre dominios en GSDMD (región 1: V229–F232) son necesarios para la oligomerización de poros8 (Datos extendidos, Figs. 6 y 9e). La mutación de la región correspondiente en las isoformas 1 y 4 de GSDMB ("AGLD" en la isoforma 1 y "NIHF" en la isoforma 4 a "GGGG", respectivamente) comprometió notablemente sus actividades de formación de poros (Datos extendidos Fig. 9g, h), lo que indica un papel similar de la región 1 en GSDMB. La siguiente secuencia (región 2: P233–Q241 en GSDMD humana) en el enlazador entre dominios no se consideró previamente como un elemento estructural involucrado en la formación de poros8,9,23. Sorprendentemente, la densidad de la región 2 en el poro GSDMB también es visible, independientemente de la resolución relativamente más baja (Datos extendidos Fig. 9f). Sugerimos que la región 2 puede estabilizarse mediante ciertas interacciones en el poro. La región 2 en la GSDMD humana contiene tres residuos básicos con sus cadenas laterales cargadas positivamente apuntando hacia la membrana, probablemente formando un sitio de unión a lípidos adicional (BS4) para la unión a la membrana (Fig. 5d). El enlazador canónico entre dominios en GSDMB también contiene residuos básicos en la región 2 (Fig. 4a y Datos extendidos Fig. 6). Sin embargo, solo un residuo básico (R229) se conserva estructuralmente en el poro de la isoforma 1 de GSDMB. Debido a una inserción de cuatro aminoácidos (222AGLD225) en el enlazador entre dominios, el residuo en la primera posición (P1) se reemplaza por un D225 cargado negativamente (Fig. 5e). La sustitución por un residuo ácido en esta posición probablemente debilita la unión de la membrana al repeler la superficie ácida de la membrana, lo que atenúa la actividad de formación de poros de la isoforma 1 de GSDMB. 1 y con la ayuda de la predicción AlphaFold27, muestran que las isoformas 4 y 6 se conservan estructuralmente en la GSDMD humana y conservan los tres residuos básicos, R225, K227 y K229 (Fig. 5f). Por el contrario, la isoforma 3 con un conector entre dominios truncado probablemente preservaría la interfaz de oligomerización pero carece del grupo básico para la unión a lípidos, y la isoforma 2 carece del conector entre dominios completo para la oligomerización y la unión a lípidos. Un estudio reciente que muestra que las isoformas de GSDMB sin el exón 6, que codifica la secuencia canónica en el enlazador entre dominios, no indujo piroptosis apoya fuertemente nuestro modelo3.

La mutación triple de R225E/K227E/K229E en el enlazador entre dominios de la isoforma 4 de GSDMB comprometió significativamente su actividad para inducir la fuga de liposomas in vitro (Fig. 5g) y para mediar la muerte celular piroptótica (Fig. 5h y Datos extendidos Fig. 9i), confirmando el papel crítico de BS4 en la mediación de la formación de poros GSDMB. También se observaron resultados similares cuando mutamos los residuos correspondientes en GSDMD humano (Fig. 5g, hy Datos extendidos Fig. 9j). Colectivamente, llegamos a la conclusión de que el conector entre dominios es el elemento estructural clave que regula la actividad piroptótica de las isoformas de GSDMB, mediante la mediación de la oligomerización de poros y la provisión de un sitio de unión a lípidos adicional.

Nuestras estructuras crio-EM del complejo GSDMB-IpaH7.8 y el poro GSDMB demuestran los mecanismos estructurales que subyacen al reconocimiento de GSDMB por el efector bacteriano y la actividad piroptótica de GSDMB, respectivamente.

La estructura del complejo GSDMB-IpaH7.8 identifica un motivo de tres residuos cargados negativamente en el bucle N-terminal α1-β1' en GSDMB y GSDMD humano como el determinante estructural reconocido específicamente por Shigella IpaH7.8. IpaH7.8 no se une a GSDMD de ratón, en el que el motivo α1–β1' no está conservado, lo que hace que Shigella no sea capaz de establecer la infección de manera eficaz en el ratón. Anteriormente, se informó que IpaH7.8 se unía a GSDMD de ratón con una afinidad aún más fuerte que a GSDMD18 humano, lo que es inconsistente con nuestros resultados. Esta discrepancia se puede atribuir a los diferentes métodos utilizados. El método de termoforesis a microescala utilizado en ese estudio previo requiere el etiquetado de la proteína con tintes fluorescentes hidrofóbicos, lo que puede cambiar el comportamiento de la proteína, lo que lleva a resultados confusos28,29. Alternativamente, el método ITC que usamos aquí mide de manera confiable la afinidad de unión de las proteínas en sus estados nativos sin el requisito de etiquetado30. Esto también está respaldado por nuestros experimentos de mutagénesis y un informe de estudio reciente31.

Nuestro estudio demuestra una inhibición altamente eficiente de GSDMB por parte de IpaH7.8: la unión de IpaH7.8 a GSDMB evitó directamente su asociación con la membrana. Además, la posterior ubiquitinación de GSDMB por IpaH7.8, cuando Shigella secuestra el sistema de ubiquitinación del huésped, inhibe aún más la actividad de GSDMB. Esta inhibición está mediada por la ubiquitinación de tres lisinas en la segunda horquilla transmembrana de GSDMB. La ubiquitinación probablemente afecta la inserción de GSDMB en la membrana, inhibiendo así su actividad de formación de poros. Esta inhibición múltiple de GSDMB por parte de IpaH7.8 dota a Shigella de una forma muy eficaz de escapar del ataque de los linfocitos citotóxicos y las células asesinas naturales durante la infección5, promoviendo la supervivencia bacteriana en el nicho de replicación del huésped.

La estructura crio-EM del poro GSDMB ilustra un mecanismo único de oligomerización de poros y unión a lípidos regulado por un enlazador entre dominios. GSDMB se expresa ampliamente en varios tipos de células y tejidos5,32,33, donde sus isoformas con distintos conectores entre dominios pueden regularse de manera diferencial. Tales diferencias en la expresión y actividades de las isoformas de GSDMB probablemente representan una estrategia del huésped para ajustar los resultados específicos del tipo de célula de la activación de GSDMB. Por ejemplo, las isoformas piroptóticas de GSDMB son dominantes en las células epiteliales y son responsables de la eliminación del nicho de replicación de los patógenos intracelulares a través de la inducción de piroptosis en las células infectadas, mientras que la isoforma 1 no piroptótica puede ser dominante en los macrófagos o las células dendríticas donde ataca y mata. bacterias citosólicas, en lugar de inducir la piroptosis, asegurando así la supervivencia de estas células presentadoras de antígenos para la activación de las células T. Actualmente, la distribución, la abundancia y la función específicas de cada célula de cada isoforma de GSDMB no se comprenden bien. La relevancia fisiológica de las isoformas GSMDB para la inmunidad antibacteriana necesita más investigación.

Tanto GSDMB como GSDMD son generalmente importantes con respecto a la inmunidad innata a los patógenos bacterianos. Sin embargo, un patógeno como Shigella que interfiere con GSDMB y GSDMD en humanos minimiza su contribución a la defensa del huésped, lo que explica por qué los humanos son susceptibles a Shigella mientras que los ratones, que carecen de GSDMB y cuya GSDMD no es sensible a IpaH7.8, exhiben resistencia4,18. Vale la pena señalar que las personas con shigellosis generalmente se recuperan en 5 a 7 días sin necesidad de antibióticos34, lo que sugiere que GSDMB y GSDMD, aunque son el objetivo de IpaH7.8, aún podrían desempeñar un papel en hacer que Shigella sea infecciosa para los humanos.

Además de la infección bacteriana, GSDMB se asocia con varios tipos de cáncer. Un estudio reciente indicó que la expresión de la isoforma 2 no piroptótica era mayor que la de otras isoformas en pacientes con cáncer de mama3. La regulación al alza de las isoformas 2 y 3 puede promover la tumorigénesis y la metástasis, lo que conduce a una supervivencia general deficiente del paciente, mientras que la alta expresión de la isoforma piroptótica 4 tiene el efecto contrario3. Teniendo en cuenta esta asociación potencial entre las isoformas de GSDMB y la supervivencia del cáncer, se justifican más estudios para explorar si las células cancerosas aprovechan la expresión diferencial de las isoformas de GSDMB para resistir el ataque de los linfocitos citotóxicos.

Las secuencias codificantes de GSDM de longitud completa se clonaron en un vector pET28-His-SUMO después de la etiqueta N-terminal His6-SUMO. Con respecto a la construcción GSDMB utilizada para la determinación estructural crio-EM, se insertó un sitio de proteasa 3C (3C) de rinovirus humano (LEVLFQ/GP) después del residuo K239. La secuencia codificante de S. flexneri IpaH7.8 se clonó en un vector pET26b con una etiqueta 6XHis C-terminal y se clonó en el vector pET22b sin una etiqueta de afinidad para la coexpresión con GSDMB. Caspasa-11 (96–373) se clonó en un vector pET22b para purificar la forma activa del complejo p20–p10. Para los experimentos celulares, se clonaron GSDM (longitud completa) y GSDM-N en un vector pcDNA3.1 en el que se fusionó una etiqueta FLAG en el extremo C mientras que se insertó IpaH7.8 en un vector pCMV-HA, lo que resultó en un proteína de fusión con una etiqueta HA N-terminal. Todas las mutaciones en este estudio se introdujeron utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Stratagene) o Gibson Assembly Master Mix (New England BioLabs), y todos los plásmidos se verificaron mediante secuenciación.

Para obtener el complejo GSDMB-IpaH7.8, se cultivaron células de E. coli BL21 (DE3) que albergaban los plásmidos de expresión pET28-His-SUMO-GSDMB y pET22b-IpaH7.8 en caldo de lisogenia suplementado con 50 µg ml–1 de kanamicina y 100 µg ml–1 de ampicilina a 37 °C. La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de β-D-1-tiogalactopiranósido de isopropilo 0,5 mM a 20 °C durante 16 h cuando la densidad óptica (OD600) alcanzó 0,8. Las células se recogieron por centrifugación a 5000 g durante 20 min. Las células recolectadas se lisaron mediante sonicación en un tampón que contenía Tris-HCl 25 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, β-mercaptoetanol 2 mM e imidazol 25 mM. Los lisados ​​se centrifugaron a 18 000 gy 4 °C durante 30 min para eliminar las fracciones insolubles. Los sobrenadantes que contenían proteínas recombinantes se purificaron usando agarosa Ni-NTA (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. La eliminación de la etiqueta His6-SUMO se realizó en una columna Ni-NTA a 4 °C durante la noche con la adición de Ulp1 recombinante. Las proteínas no marcadas de flujo continuo se purificaron aún más usando una columna de intercambio iónico Hitrap Q HP (Cytiva), luego una columna de exclusión por tamaño Superdex Increment 200 (10/300) (Cytiva) en un tampón que contenía HEPES 25 mM pH 7.5 y 150 mM NaCl. Todas las proteínas purificadas se confirmaron mediante tinción con azul de Coomassie de SDS-PAGE.

Se aplicaron protocolos similares para la expresión y purificación de todos los GSDM individuales, IpaH7.8 y sus mutantes, excepto que la etiqueta His6-SUMO se retuvo para los GSDM utilizados en el ensayo de ubiquitinación in vitro. Todas las proteínas purificadas se concentraron a aproximadamente 5–10 mg ml–1 antes de su uso.

El plásmido GZMA pET26b-GZMA fue un amable regalo de J. Lieberman35. Los plásmidos de E1 (pET21d-hUbE1), E2 (pET15-hUbE2D2) y ubiquitina (pET15-Ub) fueron obsequios de C. Wolberger, W. Harper y R. Klevit, respectivamente36,37,38. La expresión y la purificación siguieron los protocolos anteriores.

Las reacciones de ubiquitinación in vitro se realizaron en tampón A (HEPES 25 mM pH 7,5, NaCl 50 mM, DTT 0,1 mM, MgCl2 10 mM y ATP 5 mM). Los componentes se mezclaron como se indica a concentraciones de 0,4 µM E1 (UbE1 humana), 2 µM E2 (humana UbE2D2), 10 µM E3 (mutante IpaH7.8WT o IpaH7.8C357A), ubiquitina 200 µM y GSDM 10 µM (WT o mutantes indicados). ). Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 2 h y se detuvieron mediante la adición de colorante de carga SDS-PAGE, seguido de ebullición durante 5 min antes de la electroforesis. La ubiquitinación se evaluó mediante tinción con azul de Coomassie de SDS-PAGE.

El ensayo de fuga de liposomas se realizó siguiendo un protocolo establecido9. Brevemente, se mezclaron 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina y PS o CL (Avanti Polar Lipids) en la proporción indicada en un tubo de vidrio. El disolvente cloroformo se evaporó bajo una corriente de gas nitrógeno durante 30 min. A continuación, la película lipídica seca se rehidrató con tampón B (HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) complementado con 6-FAM 50 mM (Tokyo Chemical Industry). A continuación, los liposomas cargados con 6-FAM se extruyeron a través de una membrana de 1 μm (Whatman Nuclepore) utilizando una miniextrusora (Avanti Polar Lipids). Para eliminar el 6-FAM sin encapsular, los liposomas extruidos se sometieron a una columna de desalinización PD-10 (Cytiva) equilibrada con tampón B. Para el ensayo de fuga de liposomas, los liposomas se incubaron con proteínas de GSDMB/D y/o IpaH7.8 con o sin enzimas activadoras (GZMA para GSDMB y caspasa-11p10/p20 para GSDMD). Las reacciones se realizaron en una placa de 384 pocillos, con la liberación del colorante 6-FAM monitorizado por fluorescencia a 517 nm utilizando un lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices) con excitación a 495 nm durante 60 min a intervalos de 1 min.

Los liposomas se prepararon como se describe anteriormente, excepto que no se usó colorante fluorescente. Los liposomas se incubaron con proteínas GSDMB/D en/sin la presencia de IpaH7.8 en diversas proporciones molares con o sin enzimas activadoras. Las mezclas se incubaron durante 30 min a 4 °C antes de la sedimentación a 20 000 g durante 30 min a 4 °C. Los sobrenadantes se transfirieron inmediatamente a tubos nuevos y los sedimentos se lavaron dos veces con tampón B y luego se resuspendieron en un volumen igual de tampón. Las proteínas tanto en los sedimentos como en el sobrenadante se analizaron luego mediante tinción con azul de Coomassie de SDS-PAGE.

Las concentraciones de proteína de GSDM no etiquetados e IpaH7.8 se midieron por triplicado utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific) en función de sus coeficientes de extinción. Las mediciones de calorimetría de titulación isotérmica se realizaron a 20 ° C utilizando un microcalorímetro VP-ITC (MicroCal). Los experimentos se realizaron mediante la inyección de 250 μl de solución IpaH7.8 (200 μM) en una celda de muestra que contenía 2 ml de GSDMB (10 μM) en Tris-HCl 25 mM pH 8,0 y NaCl 150 mM. En total, se administraron 25 inyecciones a intervalos de 300 s. Con respecto a la GSDMD humana (hGSDMD) y la GSDMD de ratón (mGSDMD), se titularon 250 μl de solución de IpaH7.8 (625 μM) en una celda de muestra que contenía 2 ml de hGSDMD (40 μM) o mGSDMD (40 μM). Todos los datos de ITC se analizaron con Origin Software proporcionado por el fabricante y se ajustaron a un modelo de enlace de un sitio.

Las células 293T se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se comprobaron con frecuencia en cuanto a sus características morfológicas y funcionalidades. Las células se cultivaron en DMEM (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (Gibco) y l-glutamina 2 mM a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %. La transfección transitoria en células 293T se realizó utilizando Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para la detección de la ubiquitinación de GSDMB en las células, se cotransfectó pcDNA-FLAG-GSDMB (isoforma 1) con pCMV-HA-IpaH7.8 (WT o mutantes indicados) en células HEK293T en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm. Ocho horas después de la transfección, se añadió una concentración final de bortezomib 10 μM (Sigma Aldrich) al cultivo celular para reducir la degradación de proteínas mediada por proteasoma. Después de otras 8 h, las células se recogieron y se lisaron en Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NP-40 al 0,5 % y cóctel inhibidor de proteasa 1x (Sigma Aldrich). Se añadió lisado a 25 μl de perlas magnéticas Anti-FLAG M2 (Sigma Aldrich, n.º M8823) y se incubó a 4 °C durante 3 h con rotación suave. Las perlas se lavaron tres veces con tampón PBS y luego se eluyeron con 50 μl de tampón PBS que contenía 100 μg ml–1 de péptido FLAG (Sigma Aldrich, no. F3290). Las muestras eluidas se hirvieron con un volumen igual de tampón de carga SDS 2x (Bio-Rad) y luego se procesaron para inmunotransferencia con uno de los siguientes anticuerpos: anti-FLAG (Sigma Aldrich, no. F1804, 1:1000), anti-actina ( Cell Signaling Technology, n.° 3700S, 1:1000), anti-HA (Cell Signaling Technology, n.° 3724S, 1:1000) o antiubiquitina (Thermo Fisher Scientific, n.° PA3-16717, 1:1000).

Se cotransfectó uno de cada uno de los plásmidos pcDNA-FLAG-GSDMB y pcDNA-FLAG-GSDMD (250 ng) (mutantes WT o indicados) con 500 ng del plásmido pCMV-HA-IpaH7.8 en células HEK293T sembradas en una placa de 12 pocillos a 1,5 × 105 células por pocillo. Después de 40 h, las células se lisaron en tampón RIPA (Thermo Fisher Scientific), se agregaron a un volumen igual de tampón de carga SDS 2x (Bio-Rad) y se procesaron para inmunotransferencia.

La muerte celular se determinó mediante el ensayo de doble tinción Hoechst/PI: 150 ng de la construcción pcDNA-FLAG-GSDMB indicada o 75 ng del plásmido pcDNA-FLAG-GSDMD (FL, NT o mutantes indicados) se transfectaron en células HEK293T sembradas en un Placa de 96 pocillos a 2 × 104 células por pocillo. Para la inhibición de IpaH7.8, se cotransfectó pcDNA-FLAG-GSDMB-NT (isoforma 4) con 200 ng del plásmido pCMV-HA-IpaH7.8 (WT o C357A). A continuación, las células transfectadas se cultivaron durante un máximo de 40 h. Al comienzo del ensayo, las células se tiñeron con PI 30 μM (Sigma Aldrich) durante 10 minutos, seguido de Hoechst 33342 15 μM (Thermo Fisher Scientific) durante 15 minutos a 37 °C en la oscuridad. Posteriormente, las células se visualizaron usando un ZOE Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad). La muerte celular se cuantificó y expresó como el porcentaje de células positivas para PI entre las células totales (células teñidas con Hoechst).

Escherichia coli DH5α se cultivó durante la noche en medio BHI, luego se diluyó al día siguiente a 1:100 en BHI y se cultivó durante 2 h más a 37 °C hasta la fase exponencial. A continuación, se recogió 1 ml del cultivo bacteriano mediante centrifugación a 5000 g durante 2 min y se resuspendió en tampón B hasta una densidad celular bacteriana final de 5 × 108 ml–1. Para el ensayo de destrucción, se añadieron 5 μl de bacterias a una reacción de 15 μl que contenía GSDMB de longitud completa 10 μM en ausencia o presencia de GZMA. Las reacciones se realizaron a 37 °C durante 2 h. Después de la incubación, se sembraron 5 μl de bacterias tratadas en 200 μl de BHI en placas de 96 pocillos de fondo plano. El crecimiento bacteriano se controló leyendo la absorbancia a 600 nm durante 6 h utilizando un lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices). El número de unidades formadoras de colonias (CFU) recuperadas se calculó mediante la normalización de la OD600 de las bacterias tratadas (con GZMA en las reacciones) a las bacterias no tratadas (tampón o sin GZMA).

Se añadió la isoforma 1 de GSDMB purificada a los liposomas preparados, seguido de la adición de proteasa 3C para iniciar la formación de poros. La reacción transcurrió en hielo durante 3 h. Los liposomas cargados con poro GSDMB se solubilizaron con C12E8 al 2% (Anatrace) para extraer los poros. Para eliminar las partículas que se comportan mal y GSDMB-C, las muestras se purificaron aún más utilizando una columna de exclusión por tamaño de aumento Superose 6 (10/300) (Cytiva) equilibrada con tampón B (HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y C12E8 al 0,006 %). .

Para la tinción negativa, se aplicaron 10 μl del complejo GSDMB-IpaH7.8 o del poro GSDMB a una rejilla de cobre recubierta de carbono y descargada luminiscente (Electron Microscopy Sciences). La muestra se incubó en la rejilla durante 1 min, se tiñó con acetato de uranilo al 1% durante 1 min y se secó. Las imágenes de las cuadrículas se tomaron en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-7650 equipado con una cámara CCD de 2k (técnicas de microscopía avanzada) en la instalación de microscopía electrónica de UCONN Health.

Para el complejo GSDMB–IpaH7.8, se aplicaron 3,5 μl de muestra recién purificada a 0,5 mg ml–1 a rejillas de cobre perforadas Quantifoil con descarga luminiscente de plasma (R 1.2/1.3, malla 400, Electron Microscopy Sciences) usando un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) fijado en fuerza de transferencia 4, tiempo de transferencia 5,5 s, 100 % de humedad y 4 °C. Las rejillas secadas se sumergieron inmediatamente en etano líquido y se transfirieron a nitrógeno líquido para su almacenamiento. Se recopiló un conjunto de datos crio-EM en las instalaciones crio-EM de la Universidad Case Western Reserve en un microscopio electrónico Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) equipado con un detector de electrones directo K3 Summit (Gatan) y un filtro de energía posterior a la columna (Gatan) en modo de conteo usando serialEM. Se grabaron un total de 3128 películas con valores de desenfoque que oscilaban entre -0,8 y -2,5 μm con un aumento de ×105 000 y un tamaño de píxel de 0,414 Å. Para cada película, se adquirieron 58 fotogramas durante 5,25 s con una dosis total aproximada de 66,95 e− Å–2.

Para los poros de GSDMB, los poros de GSDMB solubilizados con detergente se concentraron a 0,6 mg ml–1 y luego se congelaron en rejillas de cobre perforadas Quantifoil recubiertas con una película de carbono ultrafina (R 1.2/1.3, malla 400, Electron Microscopy Sciences). Brevemente, se aplicó una gota de 3 μl de muestra de poro de GSDMB a una rejilla de carbono lacey descargada por resplandor de plasma montada en un Vitrobot. Luego, la cuadrícula se secó con papel de filtro durante 6 s con una fuerza de transferencia de 10 después de un tiempo de espera de 2 s. La humedad y la temperatura en el Vitrobot se ajustaron al 100 % y 4 °C, respectivamente, durante toda la operación. A continuación, la rejilla seca se sumergió en etano líquido y se transfirió a nitrógeno líquido para su almacenamiento. El conjunto de datos de crio-EM se recopiló en las instalaciones de crio-EM de la Facultad de Medicina Chan de la Universidad de Massachusetts en un microscopio electrónico Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) equipado con un detector de electrones directo K3 Summit (Gatan) y un filtro de energía posterior a la columna. (Gatán). Se recopilaron un total de 6376 películas en modo de conteo, cada una con 50 fotogramas y una dosis de exposición total de 50 e–1 Å–2. La ampliación se fijó en 105 000, el tamaño de píxel fue de 0,83 Å y el rango de desenfoque de −1,0 a −2,0 μm.

Las películas sin procesar se corrigieron por referencia de ganancia y por movimiento inducido por haz y se sumaron a imágenes con corrección de movimiento usando MotionCor2 (ref. 39). Los parámetros de CTF se determinaron utilizando CTFFind4 (ref. 40) y se refinaron más tarde en cryoSPARC41.

Para el complejo GSDMB-IpaH7.8, después de la recolección de partículas utilizando el modelo general en crYOLO42, las coordenadas (1 522 742 partículas en total) se transfirieron a cryoSPARC para su posterior procesamiento. Se realizaron varias rondas de clasificación 2D para eliminar el hielo, los bordes de carbono y las partículas falsas positivas que contenían ruido. Se seleccionaron las clases más frecuentes que contenían 307.276 partículas y se sometieron a una reconstrucción 3D ab initio seguida de un refinamiento heterogéneo. La clase óptima, que contiene 113 959 partículas, se seleccionó para un refinamiento homogéneo y no uniforme43. La resolución del mapa de densidad de electrones final se estimó en 3,8 Å, según el criterio de correlación de capa de Fourier (FSC) estándar de oro de 0,143 (ref. 44). La distribución de resolución local del mapa fue determinada por ResMap45. El mapa de densidad afilado en cryoSPARC se utilizó para producir figuras.

Para los poros de GSDMB, se extrajo inicialmente un total de 692 212 partículas mediante la recolección manual y automática de partículas en cryoSPARC. La clasificación bidimensional se realizó en cryoSPARC para eliminar el hielo, los bordes de carbono y las partículas falsas positivas que contenían ruido. Después de la clasificación 2D, se importaron 156 037 partículas a Relion-4.0 para la clasificación 3D con un modelo inicial generado de novo en cryoSPARC utilizando el mismo conjunto de partículas. La simetría C1 se utilizó para la primera ronda de clasificación 3D; Se seleccionaron clases 3D con características relativamente claras de simetría C24 para una ronda adicional de clasificación 3D con simetría C24 para descartar partículas malas. A continuación, 41 799 partículas de la clase 3D con resolución óptima se importaron nuevamente a cryoSPARC para un refinamiento no uniforme. Con la simetría C24, la resolución del mapa de poros GSDMB fue de 4,96 Å, según lo medido por el estándar de oro FSC de 0,143. El refinamiento del enfoque con una máscara que excluye la región del barril β mejoró la resolución local del dominio globular GSDMB a 4,48 Å.

Los modelos atómicos tanto del complejo IpaH7.8–GSDMB como del poro GSDMB se construyeron y refinaron en densidad crio-EM utilizando Coot46 y PHENIX47. Para el complejo IpaH7.8-GSDMB, se utilizaron como modelos de partida las estructuras predichas por AlphaFold2 de IpaH7.8 y GSDMB27. Los modelos de IpaH7.8 y GSDMB se acoplaron a la densidad EM como un cuerpo rígido en UCSF Chimera48 y luego se ajustaron manualmente en Coot. El modelo estructural del complejo se perfeccionó aún más utilizando 'phenix.real_space_refine', con restricciones de estructura secundaria y Coot iterativamente. La calidad del modelo atómico fue evaluada por Molprobity49. Para los poros de GSDMB, la estructura de GSDMB en el complejo IpaH7.8-GSDMB se utilizó como modelo inicial. Luego se realizó un procedimiento similar para un mayor ajuste y refinamiento. Las figuras se prepararon utilizando PyMOL (Schrödinger) y UCSF Chimera.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas del complejo GSDMB-IpaH7.8, los poros GSDMB y los poros GSDMB sin el barril β se han depositado en el Protein Data Bank (PDB) con los números de acceso. 8EFP, 8ET2 y 8ET1, respectivamente. Los mapas de densidad crio-EM asociados se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica con los números de acceso. EMD-28087, EMD-28584 y EMD-28583, respectivamente. Todos los demás datos están disponibles del autor correspondiente a petición razonable. Varias coordenadas estructurales en la base de datos PDB utilizada en este estudio se pueden ubicar mediante los números de acceso. 6CB8, 5B5R, 6N9O, 6N9N, 6VFE, 7V8H y 3CVR.

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Agradecemos a S. Dou (QuintaraCT, Inc.), X. Li y Y. Wang por los debates. Este trabajo fue apoyado por UConn Health Start-up Fund y los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (nº de subvención R01AI158435 a JR y R01AI119015 a VAR).

Estos autores contribuyeron por igual: Sonia Shivcharan, Tian Tian, ​​Skylar Wright

Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, Centro de Salud de la Universidad de Connecticut, Farmington, CT, EE. UU.

Chengliang Wang, Sonia Shivcharan, Tian Tian, ​​Skylar Wright, Danyang Ma, Vijay A. Rathinam y Jianbin Ruan

Departamento de Bioquímica y Biotecnología Molecular e Instalaciones Básicas de Microscopía Crioelectrónica, Facultad de Medicina Chan de la Universidad de Massachusetts, Worcester, MA, EE. UU.

JengYih Chang, Kangkang Song y Chen Xu

Núcleo de microscopía crioelectrónica, Facultad de Medicina de la Universidad Case Western Reserve, Cleveland, OH, EE. UU.

Kunpeng Li

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JR y CW concibieron el estudio. Proteínas expresadas y purificadas de CW, TT y DM. CW reconstituyó los poros de GSDMB. CW examinó rejillas y recopiló datos crio-EM, con la ayuda de JC, KL, KS y CXCW y JR determinó estructuras crio-EM. CW y JR realizaron experimentos bioquímicos. SS, TT, SW y CW realizaron experimentos celulares. JR y VAR supervisaron el proyecto. Todos los autores organizaron y analizaron los datos. JR y CW escribieron el documento, con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Jianbin Ruan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, perfil de filtración en gel y SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie del complejo GSDMB-IpaH7.8. Resultados representativos de más de 3 experimentos independientes. b, Un breve diagrama de flujo de la recopilación y el proceso de datos crio-EM de una sola partícula. c, mapa Cryo-EM (panel superior) y estimación de resolución local (panel inferior) del complejo GSDMB-IpaH7.8 calculado con ResMap. La resolución más alta se observa en el dominio IpaH7.8-LRR y el dominio GSDMB-N. GSDMB-C exhibe una resolución relativamente baja. d, la curva estándar de correlación de capa de Fourier (FSC) para el mapa general y las correlaciones de modelo a mapa del complejo GSDMB-IpaH7.8.

a, Comparación estructural de GSDMB-C en el complejo IpaH7.8-GSDMB y la estructura cristalina informada (PDB: 5TJ2). Los colores van desde el azul en el extremo N hasta el rojo en el extremo C. b, Alineación de secuencias basada en la estructura de GSDM humanos y GSDMD de ratón. Las estructuras cristalinas previamente informadas de hGSDMD (PDB: 6N9O) y mGSDMD (PDB: 6N9N), y las estructuras predichas por AlphaFold2 de GSDMA humana (hGSDMA), GSDMC humana (hGSDMC) y GSDME humana (hGSDME) se alinean contra GSDMB usando PROMALS3D. Los elementos estructurales secundarios de GSDMB se indican encima de la secuencia. También se indican el enlazador entre dominios y el subdominio C-terminal. Los dos elementos estructurales que interactúan con IpaH7.8 están marcados con cuadros rojos y verdes, respectivamente. Los tres residuos cargados negativamente en el bucle α1-β' se indican con puntos rojos, y la inserción de arginina (mR20) en el GSDMD de ratón se indica con un triángulo azul.

a, Una vista de primer plano del parche de interacción I en el complejo GSDMB-IpaH7.8. GSDMB se muestra como un diagrama de cinta. Dos residuos cargados negativamente se muestran como barras. IpaH7.8 se muestra como potenciales electrostáticos. Se etiqueta la distancia entre los dos pequeños bolsillos básicos formados por R186 y H209 y los residuos circundantes en IpaH7.8. b, Alineación de secuencias de los dominios LRR de Shigella IpaHs. Los elementos estructurales secundarios se indican encima de la secuencia. Los residuos universalmente conservados están marcados con un tono rojo y los residuos parcialmente conservados están coloreados en rojo. Los residuos involucrados en Interface Patch II y I se indican mediante puntos rojos y triángulos verdes, respectivamente. c, inmunotransferencias de células 293T cotransfectadas con GSDMB marcado con FLAG y HA-IpaH7.8 (WT o mutantes indicados). Resultados representativos de 3 experimentos independientes.

a—c, medición basada en ITC de las afinidades de unión de IpaH7.8 con GSDMB (a), humano (hGSDMD) (b) y ratón GSDMD (mGSDMD) (c), respectivamente. Kd, constante de disociación; N, la estequiometría del complejo. DP, potencia diferencial medida por la máquina ITC; ΔH, cambio de calor medido por la máquina ITC. Se muestra la media ± SD (n = 3). d-f, perfiles de filtración en gel y SDS-PAGE teñidas con azul de Coomassie de IpaH7.8 incubadas con GSDMB (d), GSDMD humana (hGSDMD) (e) o GSDMD de ratón (mGSDMD) (f). Resultados representativos de más de 3 experimentos independientes. g,h, perfiles de filtración en gel IpaH7.8 incubados con mutantes GSDMB- (g) o GSDMD-D17S/R20Ins (h) humanos, respectivamente. Resultados representativos de 3 experimentos independientes. i, Una vista de primer plano de la interfaz entre IpaH7.8 y GSDM. Las estructuras de GSDMA humano (hGSDMA; predicho AlphaFold2), GSDMC humano (hGSDMC; predicho AlphaFold2), GSDMD humano (PDB: 6N9O), GSDME humano (hGSDME; predicho AlphaFold2) y GSDMD de ratón (PDB: 6N9N) se superponen en GSDMB en la estructura del complejo GSDMB-IpaH7.8. Se muestran las secuencias de aminoácidos de la hebra β3 que interactúa con IpaH7.8 de cada GSDM. j, SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie de ubiquitinación in vitro de GSDMD humana y de ratón (WT y mutantes indicados). mβ3, reemplaza la hebra β3 en GSDMD humana con la secuencia de ratón correspondiente. GSDMBβ3 reemplaza la hebra β3 en GSDMD de ratón con la secuencia GSDMB correspondiente. Las mutaciones no alteraron la ubiquitinación in vitro. Resultados representativos de 3 experimentos independientes.

a, Los perfiles de filtración en gel no indican interacción entre GSDMB y el mutante IpaH7.8-Y165E/Y166E o el mutante IpaH7.8-R186E/R228D. Resultados representativos de más de 3 experimentos independientes. b, La capacidad de GSDMB para inducir la fuga de liposomas cuando se incuba con IpaH7.8 (WT) a diferentes dosis. Cada punto representa la media ± SD de 3 repeticiones técnicas. c, asociación de GSDMB con liposomas CL en presencia de IpaH7.8 en un ensayo de sedimentación de liposomas. FL: de cuerpo entero; N: dominio N-terminal; y C: dominio C-terminal. Las SDS-PAGE se tiñeron con azul de Coomassie. Resultados representativos de 3 experimentos independientes. d, La capacidad de GSDMD humana para inducir la fuga de liposomas de liposomas CL en presencia de IpaH7.8 a diferentes dosis. Cada punto representa la media ± SD de 3 repeticiones técnicas. e, ensayo de sedimentación de liposomas que muestra la asociación de GSDMD humana con liposomas CL en presencia de IpaH7.8. Resultados representativos de 3 experimentos independientes. f, Los ensayos de sedimentación de liposomas muestran la asociación de GSDMD humana ubiquitinada o no ubiquitinada con liposomas CL. Resultados representativos de 3 experimentos independientes. g, Los ensayos de fuga de liposomas muestran el efecto de la ubiquitinación en la inhibición de las actividades de formación de poros de la GSDMD humana. Los datos se normalizaron con la fluorescencia observada después de agregar detergente y se establecieron en cero de la fluorescencia justo antes de la adición de proteínas. Cada punto representa la media ± SD de 3 repeticiones técnicas. h, Ubiquitinación in vitro de mutantes de GSDMB con lisinas mutadas en argininas. 3R, con K177, K192 y K192 mutados en argininas en GSDMB. Las SDS-PAGE se tiñeron con azul de Coomassie. Resultados representativos de 3 experimentos independientes.

Los elementos estructurales secundarios de GSDMB y GSDMD humana (PDB: 6VFE) se indican encima y debajo de la secuencia, respectivamente. Las dos horquillas transmembrana están resaltadas en cuadros naranjas. Todas las lisinas tanto en GSDMB como en GSDMD humano están coloreadas de azul. Las lisinas que se predijo que estarían involucradas en la formación de poros y que se examinaron para la ubiquitinación en nuestro estudio están resaltadas en cuadros azules. La secuencia "canónica" en el enlazador entre dominios GSDMB está resaltada en un cuadro verde. Los residuos en el enlazador entre dominios que pueden mediar en la oligomerización de poros y la unión de lípidos se resaltan en cuadros de líneas discontinuas rojas y con fondo azul, respectivamente.

a, Ubiquitinación in vitro de isoformas de GSDMB por Shigella IpaH7.8. Las reacciones de ubiquitinación terminadas a los 0 min por ebullición con tampón de carga SDS-PAGE se usaron como controles negativos no ubiquitinados. SDS-PAGE se tiñó con azul de Coomassie. Resultados representativos de 3 experimentos independientes. b, Efecto de la ubiquitinación en la inhibición de las actividades de formación de poros de la isoforma 6 de GSDMB mostrado por el ensayo de pérdida de liposomas utilizando liposomas CL. Cada punto representa la media ± SD de 3 repeticiones técnicas. c, escisión de isoformas de GSDMB por GZMA. Se incubaron 3,6 μg de isoformas de GSDMB con 1 μg de GZMA, respectivamente. La escisión se llevó a cabo incubando la mezcla a 37 °C durante 2 horas. Blanco * indica el GSDMB-NT. El peso molecular de GSDMB-NT de la isoforma 2 (25,9 kDa) está muy cerca de GZMA (25,8 kDa) y no se puede separar en SDS-PAGE. SDS-PAGE se tiñó con azul de Coomassie. Resultados representativos de 3 experimentos independientes. d, Efecto de las isoformas de GSDMB en la inducción de piroptosis en células HEK293T. FL: GSDMB de longitud completa; NT: dominio N-terminal de GSDMB. La barra de escala es de 100 μm. Resultados representativos de 3 experimentos independientes. e, Efecto de IpaH7.8 en la inhibición de la muerte celular piroptótica mediada por la isoforma 4 de GSDMB de células HEK293T. Resultados representativos de 3 experimentos independientes. La barra de escala es de 100 μm. f, Cuantificación de la muerte celular en (e). Barras de error, media ± SD de 3 experimentos independientes. ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Tukey en comparación con el control de células HEK293T transfectadas con plásmidos de GSDMB-NT y vector vacío. ** p < 0,005. g, Efecto de las isoformas de GSDMB en la inhibición del crecimiento bacteriano. Barras de error, media ± SD de 3 experimentos independientes. ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Tukey con muestras comparadas con sus controles no escindidos. *, p < 0,1, ***, p < 0,001, NS: no significativo.

a, Imágenes representativas de EM de tinción negativa de poros de las isoformas 4 y 6 de GSDMB extraídas de liposomas de cardiolipina usando detergente C12E8. Barra de escala: 50 nm. Resultados representativos de más de 3 experimentos independientes. b, Una imagen EM negativa representativa de poros de isoforma 1 de GSDMB solubilizados en C12E8 (panel izquierdo) y una imagen crio-EM de poros de isoforma 1 de GSDMB recopilados en un microscopio Titan Krios equipado con una cámara K3. Resultados representativos de más de 3 experimentos independientes. Barra de escala: 50 nm. c, Un breve diagrama de flujo de la recopilación de datos crio-EM de una sola partícula y el proceso del conjunto de datos de poro GSDMB. d, la curva de correlación de la capa de Fourier estándar de oro para las correlaciones de medio mapa del poro GSDMB.

a, La curva FSC estándar de oro para el preporo GSDMB. b, El mapa crio-EM (izquierda) y el mapa crio-EM ajustado con un modelo atómico (derecha) de preporo GSDMB de 24 veces. Los protómeros GSDMB tienen colores diferentes. El preporo de GSDMB no tiene la región de inserción transmembrana. Los recuadros de puntos rojos indicaron la región transmembrana faltante. c, formación de horquilla β de poro GSDMB (HP). La región β3-β5 del primer dominio de extensión (ED1) se transforma en HP1. La región β7-α4-β8 representa ED2 y se convierte en HP2. d, Dos subunidades vecinas en el poro GSDMB. Los elementos estructurales que participan en la oligomerización están etiquetados y coloreados de amarillo. e, f, se muestran las densidades Cryo-EM del enlazador entre dominios en el poro hGSDMD (e) y el poro GSDMB (f), respectivamente. Las densidades generales están coloreadas en gris con las densidades de los enlazadores entre dominios en los poros hGSDMD y GSDMB coloreados en rosa y magenta, respectivamente. Los enlazadores entre dominios están coloreados en rojo. g, una vista de primer plano de la Región 1 del enlazador entre dominios en la isoforma 1 de GSDMB. La hélice α3' forma la subunidad vecina que interactúa con el enlazador entre dominios y está coloreada de amarillo. h, Efecto de la mutación de la Región 1 en el enlazador entre dominios de las isoformas 1 y 4 de GSDMB en la inducción de fugas de liposomas (10% PS). Cada punto representa la media ± SD de 3 repeticiones técnicas. WT: GSDMB de tipo salvaje; Región 1: mutación del motivo de la Región 1 a "GGGG" en GSDMB. i, j, las células HEK293T se transfectaron transitoriamente con las construcciones indicadas de la isoforma 4 (i) de GSDMB y hGSDMD (j) durante 24 h y se tiñeron con Hoechst 33342 y PI. FL: longitud total; NTWT: GSDMB/D-NT de tipo salvaje; NTBS4: GSDMB/D-NT que alberga una mutación triple de los tres residuos básicos en la isoforma 4 de GSDMB y en hGSDMD a ácidos glutámicos en BS4. Resultados representativos de 3 experimentos independientes. La barra de escala es de 100 μm.

Este archivo contiene las inmunotransferencias sin recortar (Figuras complementarias 1 y 2).

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Reimpresiones y permisos

Wang, C., Shivcharan, S., Tian, ​​T. et al. Base estructural para la formación de poros GSDMB y su orientación por IpaH7.8. Naturaleza 616, 590–597 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05832-z

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Recibido: 18 Octubre 2022

Aceptado: 13 febrero 2023

Publicado: 29 de marzo de 2023

Fecha de emisión: 20 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05832-z

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